아넥신 V 및 카스파제 3 면역염색으로 검출된 실험적 거미막하 출혈 후 뇌실주위 기관의 세포사멸 및 괴사
목적: 심실주위 기관(CVO)은 대부분의 자율 및 내분비 기능에 필수적입니다. 외상과 출혈은 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 이 연구의 목적은 annexin V 친화성과 카스파제 3 면역염색을 사용하여 쥐의 실험적 지주막하 출혈(SAH) 후 초기 기간의 CVO에서 세포사멸과 괴사를 조사하는 것이었습니다.
방법: 세 개의 실험 그룹이 사용되었습니다: SAH 후 1일과 2일째, 그리고 대조군에는 Wistar 알비노 쥐 7마리가 각각 사용되었습니다. 지주막하 출혈은 경쇄골 기저동맥 천자를 통해 이루어졌습니다. 쥐에게 심장이 멈출 때까지 0.9% NaCl과 0.1M 인산염 완충액 pH 7.4를 관류시켰습니다. CVO의 아폽토시스 및 괴사는 아넥신 V 염색을 이용한 유세포 분석법과 카스파제 3 면역염색으로 측정했습니다.
결과: 말단 혈관 기관의 아폽토시스(OVLT) , 중앙 융기(ME) 및 사후 영역(AP)은 대조군보다 1일차 그룹에서 훨씬 더 높았습니다. 간질하 기관(SFO), OVLT, ME 및 AP의 세포사멸은 대조군보다 2일차 그룹에서 상당히 높았습니다. AP를 제외하고 1일차 그룹과 2일차 그룹 간에는 상당한 차이가 있었습니다. SFO 및 OVLT의 괴사는 1일차 또는 대조군보다 2일차 그룹에서 유의하게 높았지만 ME와 AP의 괴사는 세 그룹 간에 차이가 없었습니다. . 카스파제 3 양성 세포 밀도는 1일차 그룹과 대조군보다 2일차 그룹에서 더 강했습니다.
토론: 세포사멸을 예방하면 CVO의 기능 장애가 잠재적으로 개선될 수 있습니다. SAH.
소개
아폽토시스는 프로그램된 세포 사멸이며, 이는 지주막하 출혈과 같은 병리학적 상태에서 변경됩니다(SAH) .1 세포사멸은 초기 뇌손상,2 혈관경련,3 그리고 SAH 이후 나타나는 뇌경색4의 발병에 기여하는 요인으로 여겨집니다. 문헌에는 SAH 후 세포사멸1,2,5,6 및 괴사7,8가 보고되었으며, 세포사멸 억제제 투여 후 이러한 현상이 개선되었다는 보고가 있습니다.5,6 연구 결과에 따르면 d SAH에 따른 세포사멸 경로의 억제는 세포 사멸을 감소시킬 뿐만 아니라
기능적 결과에 상당한 개선을 가져왔고,2,4 따라서 SAH와 관련된 많은 2차 손상을 억제했을 수 있습니다. SAH.1
뇌의 여러 중요한 중추 외에도 간질하 기관(SFO)과 같은 다수의 감각 뇌실주위 기관(CVO)이 있습니다. , Organum vasculosum lamina termis(OVLT), Area postrema(AP) 및 median eminence(ME, a secretory CVO)는 SAH<의 영향을 받습니다. /strong> Strong>9,10 심실주위 기관은 신경전달물질이 풍부하고 혈액-뇌 장벽이 없습니다.11,12
Annexin V는 강력하게 상호작용하고 특히 포스파티딜세린과 함께 사용되므로 초기 세포사멸을 탐지하는 데 사용할 수 있습니다.15 Caspase 3 면역염색은 현재 조직 샘플에서 세포사멸을 탐지하는 데 사용되는 또 다른 방법입니다.16
이 연구에서 우리는 초기 및 후기 세포사멸의 존재를 조사했습니다. 쥐에서 실험적인 SAH 후 CVO에서 annexin V 친화성과 카스파제 3 면역염색에 의한 세포사멸/괴사. 문헌 검토에서 이 주제를 다루는 이전 보고서를 찾지 못했습니다.
재료 및 방법
연구 프로토콜은 Bu에 의해 승인되었습니다. ¨lent Ecevit 대학 동물 윤리 위원회.
실험은 터키 종굴다크 의과대학 Bu¨lent Ecevit 대학의 실험 수술, 연구 및 동물 실험실에서 수행되었습니다. 총 21마리의 수컷 성인 Wistar 알비노 쥐(체중 200~300g)가 연구에 포함되었습니다. 모든 쥐는 12/12시간 명암 주기로 적절한 습도와 22~25oC를 유지했으며 수분과 음식을 자유롭게 섭취했습니다. 쥐를 다음과 같이 세 그룹으로 나누었습니다: SAH 후 1일차(n=57), SAH 후 2일차(n=57) 및 대조군(n=57).
케타민(60mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 복강 내 주사하여 쥐를 마취시켰습니다. 실험적 SAH는 이전에 설명한 Barry et al.,17의 기술과 유사한 기술을 사용하여 수행되었습니다.9,10
간단히, 수술을 통해 바로 누운 자세에서 경추 정중선 절개를 실시했습니다. 현미경(Takagi OM-5, 일본)을 사용하고 전방 인두주위 접근법을 사용하여 사대를 노출시켰습니다. 뼈만 남은 윈도 기저동맥 앞의 w는 대구경 바늘을 사용하여 생성되었으며, 전교조 수조가 열리지 않도록 극도로 주의했습니다. 외경이 75mm인 봉합 바늘(Ethicon, 영국 리빙스턴)을 기저동맥에 삽입했습니다. 바늘을 빼내면 지주막하 공간으로 광범위한 출혈이 발생하고 후각 영역까지 고르게 분포됩니다. SAH 후 적절한 조건에서 쥐를 1일과 2일 동안 살려 두었습니다.
쥐는 관류로 안락사시켰습니다. 마취하에 개흉술을 시행한 후 좌심실에 캐뉼러를 삽입하고 하행 대동맥을 고정하고 우심방을 절개한 후 0.9% NaCl 및 0.1M 인산염 완충액(pH 7.4)으로 머리와 경부 부위의 혈액을 세척했습니다. 심장이 멈출 때까지. 동물의 목을 베고 쥐 정위 지도책(Paxinos & Watson)을 사용하여 SFO, OVLT, ME 및 AP 샘플을 채취했습니다(Paxinos & Watson).
Annexin V 방법의 원리 .세포사멸 동안 혈장 내막에서 외부 전단지로 전위되는 포스파티딜세린에 대한 아넥신 V의 친화력을 유동 세포 계측법으로 측정합니다.15 세포는 다양한 CVO에서 수확되었습니다. 강한 >s 별도로. 우리는 각 샘플에 100ml의 세포 현탁액을 사용했습니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 접합된 Annexin V는 요오드화 프로피듐(PI) 존재 하에서 염색된 세포사멸 세포입니다. 이 반응을 통해 세포사멸 세포 표면의 포스파티딜세린을 검출할 수 있습니다. PI 양성 세포와 Annexin V 양성 세포 모두 괴사 상태의 비율을 나타냅니다. 제조업체의 지침에 따라 상업용 Annexin-FITC 키트(Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA)를 사용했고 Coulter FC500 > > 유세포 분석기(Beckman-Coulter). 초기 세포사멸 동안 막 지질 비대칭의 손실과 포스파티딜세린에 대한 아넥신 V 특이적 결합의 도식적 표현이 그림 1에 나와 있습니다. 1. PI 양성 및 아넥신 V 양성 세포는 후기 세포사멸 또는 괴사를 나타냅니다(그림 1).
조직병리학적 및 면역조직화학적 분석을 위해 CVO 쥐의 뇌에서 얻은 뇌는 모든 그룹에 사용되었습니다. 각 쥐의 심실주위 장기 샘플을 10% 중성 포르말린 용액에 고정한 후 파라핀 왁스에 묻었습니다. 섹션은 저온 유지 장치에서 5-6mm로 절단되었습니다. 두께 그런 다음 조직 절편을 탈왁스하고 조직 형태학적 분석을 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 크레실 바이올렛으로 염색했습니다. 심실주위 기관은 연구 그룹에 대해 눈이 먼 한 명의 병리학자(FB)에 의해 광학 현미경으로 평가되었습니다. 세포사멸을 평가하기 위해 다클론 항체 항카스파제 3(CPP32)(Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, USA)을 사용한 면역조직화학적 분석도 수행되었습니다. 면역염색은 포르말린 고정 파라핀 왁스 내장 조직을 사용하여 마이크로파 항원 검색을 사용하는 스트렙타비딘 비오틴 퍼옥시다제 복합 기술을 기반으로 했습니다. 왁스가 포매된 부분을 슬라이드에 수집한 다음 왁스를 제거하고 재수화했습니다. 탈랍 후, 섹션을 여과수에 용해된 10% 과산화수소로 처리하여 내인성 과산화효소 활성을 차단했습니다. 항원 검색을 위해 슬라이드를 10mmol/L 구연산염 완충액(pH 7)으로 전자레인지에서 10분간 끓였습니다. 그런 다음 슬라이드를 카스파제 3 토끼 다클론 항체(Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA)를 포함한 1차 항혈청과 함께 배양했습니다. 인산완충 식염수로 세척한 후 슬라이드의 조직을 비오틴이 결합된 2차 항체와 함께 배양한 후 상온에서 30분간 스트렙타비딘 비오틴 시스템 성분과 함께 배양하였다. 반응은 샘플을 3,39-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드(DAB; Lab Vision, Fremont, CA, USA)에 담근 후 가시적으로 나타났습니다. 그 후, 섹션을 헤마톡실린으로 대비염색한 후 헹구고 마운트했습니다. 음성대조군은 1차 항체를 생략하였고, 편도선 조직을 양성대조군으로 사용하였다. 카스파제 3 면역반응성은 일부 핵 염색과 함께 세포질에서 주로 관찰되었습니다. 슬라이드는 한 명의 병리학자에 의해 맹검 방식으로 평가되었습니다(FB). 카스파제 3 양성 세포 밀도로 측정된 세포사멸은 각 그룹의 CVO에서 평가되었습니다.
통계 분석
사회 과학을 위한 통계 패키지 모든 데이터 분석에는 (버전 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA)가 사용되었습니다. 결과는 중앙값과 범위로 표시되었습니다. 정규분포가 없는 변수에 대한 정규성 검정에는 Shapiro-Wilk 검정을 사용하였고, 세 그룹 간의 비교에는 Kruskal-Wallis 검정을 사용했습니다. 코노버 테스트는 사후 비교에 사용됩니다. 모든 통계적 비교에서 0.05가 통계적으로 고려되었습니다.
결과
유세포 분석 결과는 표 1에 요약되어 있습니다. PI/annexin 유의 V에서 얻은 그래픽 SFO, OVLT, ME 및 AP (대조군 및 2일차 그룹)의 유세포 분석은 그림 1에 나와 있습니다. 2. 1일차 그룹의 초기 세포사멸 결과는 중앙값(범위)으로 표시되며 다음과 같습니다. OVLT 0.50%(0.08–1.89), ME 0.55%(0.21–0.84) 및 AP 0.46%(0.20–1.86), SFO의 세포사멸 대조군과 크게 다르지 않았다. 2일차 그룹의 경우 초기 세포사멸은 다음과 같습니다: SFO 1.88%(0.97–2.99), OVLT 1.85%(0.77–3.16), ME 0.79%(0.54–1.43) 및 AP 0.82%(0.19–1.49) ).) 이는 대조군보다 4개 영역 모두에서 상당히 높은 수치였습니다. 대조군에서 초기 세포사멸은 SFO에서0.12%(0.02–0.35), OVLT에서 0.15%(0.04–0.71), 0.18%(0.09–0.34)였습니다. > >ME에서는 및 AP에서는 0.06%(0.01–0.24).
SFO에서 괴사 2일차 그룹의 OVLT는 1일차 그룹과 대조군 모두에서보다 상당히 높았으며 ME 및 AP에 대한 결과는 1일차 그룹과 대조군 사이에는 차이가 없었습니다.
SFO, OVLT, ME 및 AP 섹션의 조직병리학적 검사는 2일차 그룹에서 2일차 그룹에서 더 두드러진 세포 손실을 나타냈습니다.
Caspase 3 양성 세포 밀도는 다른 두 그룹보다 2일차 그룹에서 더 강했습니다. 대조군에는 카스파제 3 양성 세포가 거의 없었고, 1일차 그룹은 2일차 그룹보다 카스파제 3 양성 세포가 더 적었습니다.
토론
아폽토시스는 세포 사멸 진화의 메커니즘 중 하나이며, 이는 임상적 및 실험적 SAH
CVO에 대한 본 연구에서
Strong>쥐의 SAH 실험 후 SFO, OVLT, AP 및 ME에서 세포사멸이 나타났습니다. 1일차 연구 그룹에서는 SFO를 제외한 모든 CVO에서 포스파티딜세린에 대한 증가된 Annexin V 친화력(초기 세포사멸)을 발견했습니다. 낮에는 2g읽기: 0
